PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN THỰC VẬT

II. PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN THỰC VẬT 

1. Thử trực tiếp với mô thực vật

            Thử với cây con. Cho hạt nẩy mầm rồi chuyển vào đĩa thạch đã cấy vi khuẩn định thử. Sau khi để tiếp xúc  với môi trường 4 giờ, cây con được lấy ra rồi để môi trường ở 35°C. Nếu có chất kháng khuẩn tiết ra từ lá mầm hoặc rễ thì sẽ gây nên những vùng vô khuẩn.

            Thử từng phần của cây. Có nhiều trường hợp chất kháng khuẩn chỉ tập trung ở từng bộ phận  nhất định của cây, muốn phát hiện có thể tiến hành như sau: cắt các  mẫu thực vật thành từng nhát chiều dày 0,5cm hoặc lấy toàn bộ một lá hoặc một bộ phận của cây đặt lên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn định thử. Sau khi để ở tủ ấm một thời gian thích hợp, quan sát vùng vô khuẩn. Có khi người ta cho thẳng cả một bộ phận thực vật vào môi trường lỏng đã cấy vi khuẩn và sau đó theo dõi mức độ kháng khuẩn.

2. Thử từ dịch chiết.

            Chuẩn bị mẫu cây. Dịch chiết có thể tiến hành từ nguyên liệu tươi hoặc khô nhưng thường dùng nguyên liệu tươi vì có trường hợp chất kháng khuẩn mất đi trong qúa trình  làm khô. Có khi người ta để cây tươi vào tủ lạnh trong vài giờ truớc khi thử để cây tạo ra chất kháng khuẩn. Cũng có trường hợp  chất kháng khuẩn được tạo ra trong quá trình làm khô.

            Dịch chiết. Có thể ép lấy từ dịch tươi để đem thử hoặc chiết với các dung môi thích hợp.

            Toàn bộ cây hoặc bộ phận của cây đem nghiền trong cối sứ với một ít nước (có thể thêm ít cát để dễ nghiền hoặc dùng máy xay) cho đến khi thu được khối nhão rồi đem lọc lấy nước để thử. Nên dùng nước nguội để khỏi làm hỏng các chất bị nhiệt phân hủy. Có khi người ta chiết bằng nước muối 0,9% hoặc nước kiềm pH 9,0 hoặc nước acid yếu hoặc mạnh (trước khi thử phải trung tính dịch chiết). Nếu hoạt chất không hòa tan trong nước thì tiến hành chiết bằng các dung môi khác như ethanol, aceton, chloroform, ether.

            Dịch chiết trước khi đem thử cần phải thanh trùng. Nếu chất kháng khuẩn dễ bị nhiệt phân hủy thì phải thanh trùng bằng lọc qua nến lọc hoặc màng lọc.

            Phương pháp thử kháng khuẩn từ  dịch chiết. Hai phương pháp chủ yếu được ứng dụng: phương pháp khuếch tán và phương pháp pha loãng.

            a) Phương pháp khuếch tán. Phương pháp này thích hợp khi nghiên cứu hàng loạt, tiết kiệm thời gian và lượng chất thử cũng không cần nhiều. Các dịch chiết bằng dung môi hữu cơ cũng thử được vì khi nhỏ lên mặt đĩa thạch, để bốc hơi thì còn lại chất thử khô trên mặt môi trường. Phương pháp khuếch tán không chỉ định tính mà còn có thể định lương một chất kháng khuẩn đã biết căn cứ  vào kích thước của vòng vô khuẩn so sánh với mẫu mà nồng độ đã biết tiến hành trong cùng điều kiện.

            Phương pháp ống trụ. Dùng các ống trụ bằng thép không rỉ hoặc bằng thủy tinh đồng đều có chiều cao 10mm, đường kính ngoài 8mm, đường kính trong 6mm, đặt lên mặt đĩa thạch đã cấy vi khuẩn định thử. Nhỏ vào mỗi ống 0,1ml dịch chiết từ dược liệu rồi để vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp, sau đó quan sát mức độ kháng khuẩn căn cứ vào đường kính các vòng vô khuẩn.

            Để cấy vi khuẩn có thể tiến hành với que cấy để đưa vi khuẩn lên mặt thạch, hoặc trộn đều hỗn dịch vi khuẩn với thạch khi thạch còn lỏng, hoặc láng hỗn dịch vi khuẩn lên mặt thạch đã đông, hoặc rót một lớp mỏng thạch đã cấy vi khuẩn lên mặt đĩa thạch đã đông.

            Nếu đối tượng thử là nấm mốc  thì hỗn dịch bào tử trước khi trộn đều với môi trường nên lọc qua bông đã khử trùng để loại các sợi nấm. Trường hợp không có bào tử thì sợi nấm phải được cấy trước trong môi trướng canh thang, sau đó môi trường này được lắc kỹ với bi thủy tinh để phân nhỏ đều sợi nấm trước khi trộn với thạch.

            Kích thước của vòng vô khuẩn có thể phụ thuộc vào tốc độ khuếch tán của chất kháng khuẩn. Ở một nồng độ nhất định muốn có vòng vô khuẩn rộng hơn thì nên để đĩa thạch (đã có chất kháng khuẩn) ở nhiệt độ thấp trong một thời gian trước khi đặt vào tủ ấm (đối với chất khuếch tán chậm).

            Dịch chiết từ thực vật bên cạnh các chất ức chế đôi khi còn có mặt các chất dinh dưỡng nên  có thể thấy hiện tượng vi khuẩn mọc nhiều hơn xung quanh vòng vô khuẩn. Hiện tượng quầng hoặc từng vòng đồng tâm đôi khi cũng nhận thấy đối với dịch chiết từ thực vật. Một số trường hợp vòng vô khuẩn chỉ xuất hiện trên mặt thạch còn trong lớp thạch lại không thấy (trường hợp trộn hỗn dịch vi khuẩn với môi trường), đó là do hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn chỉ xuất hiện khi bị oxy hóa.

            Phương pháp thạch lỗ. Phương pháp giống phương như trên chỉ khác ở chổ thay ống trụ bằng các lỗ tạo ra trong lớp thạch (dùng khoan nút chai đường kính 8mm đã khử trùng).

            Phương pháp khoanh giấy. Cũng giống phương pháp ống trụ chỉ khác là thay ống trụ bằng các khoanh giấy  thấm (cũng tạo ra bằng khoan nút chai). Các khoanh giấy thấm sau khi đã khử trùng đem đặt lên mặt đĩa thạch (đã cấy vi khuẩn) rồi nhỏ lên 2 hoặc 3 giọt dung dịch định thử. Có thể nhúng khoanh giấy vào dung dịch dược liệu rồi đặt lên đầu mũi kim cho khô trước khi đặt lên mặt thạch.

            b) phương pháp pha loãng.

            Phương pháp môi trường lỏng. Cho vào ống nghiệm thứ nhất aml dung dịch định thử, thêm đồng thể tích dung dịch môi trường (pha loãng gấp 2). Từ ống thứ nhất sau khi lắc đều lấy aml chuyển sang ống thứ hai đã có sẵn a ml môi trường (pha loãng gấp 4), cứ thế tiếp tục sang các ống nghiệm sau cho hết số ống đã định, cuối cùng lấy a ml ở ống cuối bỏ đi. Như vậy ta có một dãy ống đã pha loãng dần. Một ống làm chứng  thì chứa a ml môi trường. Thêm vào mỗi ống trên một lượng  hỗn dịch vi khuẩn như  nhau rồi để tất cả vào tủ ấm trong một thời gian thích hợp. Nếu với mục đích định lượng thì tiến hành song song với  một dãy ống khác có những nồng độ đã biết  của chất kháng khuẩn. Muốn đánh giá kết quả, ta đọc độ pha loãng lớn nhất mà vi khuẩn không mọc được. Muốn biết với độ pha loãng đó vi khuẩn bị diệt hay chỉ bị kìm hãm thì từ ống có độ pha loãng đó ta lấy một phần và chuyển vào ống nghiệm khác có chứa sẵn môi trường vô trùng. Nếu sau khi để ở tủ ấm mà vi khuẩn mọc tức là kìm hãm, nếu vi khuẩn không mọc tức là diệt.

            Phương pháp môi trường đặc. Lấy 1 lượng dịch chiết từ dược liệu cho vào hộp petri đã khử trùng. Thêm một lượng thích hợp môi trường thạch còn lỏng rồi trộn kỹ. Khi thạch rắn thì cấy vi khuẩn lên mặt thạch, để tủ ấm ở một thòi gian thích hợp, sau đó đối chiếu với mẫu không có chất kháng khuẩn.

3. Phương pháp phát hiện các chất kháng khuẩn bay hơi.

            Nhiều dược liệu chứa các thành phần bay hơi có tác dụng kháng khuẩn (ví dụ Allium cepa, A. sativum). Để phát hiện, chúng ta có thể tiến hành như sau: nghiền nguyên liệu rồi đặt một dúm nhỏ vào lòng nắp hộp petri sau đó úp nửa hộp petri có thạch đã cấy  vi khuẩn lên, nếu có chất kháng khuẩn thì sẽ tạo thành vòng vô khuẩn ở mặt thạch đối diện với nguyên liệu.

4. Phương pháp kết hợp với sắc ký.

            Chấm dịch chiết dược liệu lên giấy sắc ký, khai triển bằng hệ dung môi thích hợp, bốc hơi hết dung môi rồi đặt băng giấy sắc ký lên mặt thạch đã cấy vi khuẩn. Sau khi cho vi khuẩn mọc, các vùng vô khuẩn có thể quan sát được. Đôi khi vùng vô khuẩn có thể biết rõ và sớm hơn (4 - 5 giờ sau khi để tủ ấm) bằng cách phun dung dịch 2, 3, 5 - triphenyl tetrazolium chlorid (TTC) trong nước hoặc dung dịch 0,5% 2, 6 - dichlorophenolindophenol (DCP), sau đó để vào tủ ấm thêm 30 phút, với TTC thì vùng vô khuẩn trắng trên nền đỏ, với DCP thì xanh trên nền trắng. Sự thay đổi màu thuốc thử dựa vào dehydrogenase của vi khuẩn (Bacillus subtilis hoặc Escherichia coli).

www.duoclieu.org

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Ngô Văn Thu (2011), “Bài giảng dược liệu”, tập I. Trường đại học Dược Hà Nội

Phạm Thanh Kỳ và cs. (1998), “Bài giảng dược liệu”, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội

Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học

Viện dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, tập I, Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật.

Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, tập II, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.